引用自同济大学学报医学版2021-05-22 09:00发表于上海
复发性流产患者胎盘绒毛组织中差异表达蛋白的蛋白质组学分析
复发性流产(recurrent spontaneous abortion ，RSA)是指与同一性伴 侣连续发生≥2 次在妊娠 20 周前的胎儿丢失[1] ，是一种极为常见的妊娠并 发症 ，大约每 300 名孕妇中就有 1 位会发生 RSA[2] 。复发性流产的病因复 杂多样 ，比如父母染色体异常 ，母亲生殖道解剖结构异常 ，自身免疫性疾 病 ，内分泌失调 ，感染和精神等诸多因素[3 -4] 。然而 ，除了这些比较明确的病因外 ，临床上仍有将 40%～ 50%的 RSA 患者病因不明。
蛋白质组学在探索疾病生物标志物和病理生理机制等方面拥有巨大的 潜力 。本研究通过蛋白组学方法对 RSA 相关的分子信号通路进行综合性的 研究 ，寻找潜在的分子机制 ，以期发现新的分子靶点 ，从而降低 RSA 发生
1.9 通路富集分析
采用 KEGG 数据库进行通路的富集分析 。 费歇尔精确双端检验方法被 用于检验差异表达蛋白在以鉴定到的蛋白为背景。通路富集检验 P0.05 认 为差异有统计学意义 。 最后根据 KEGG 网站通路层级分类方法将这些通路
进行分类。
1.10 差异蛋白的网络信号分析(IPA)
将包含所有差异表达蛋白质的列表(以 Uni Prot 编号形式)和差异倍数值 上传到 IPA 软件(2000— 2018QIAGEN)中进行分析 。 P值在 IPA 中基于Right-Tailed Fisher ’s Exact Test 算法 ，可以分析相关的经典通路。
1.11 蛋白互作网络(PPI)分析与枢纽蛋白
将 342 个差异蛋白分子 ，上传至 STRING 网站(https：∥http://string-db.org/) ， 将 网 络 互 作 结 果 导 出 。 再 将 导 出 的 string_interactions.tsv 文 件 导 入 Cytoscape 软件 ，运用 cytohubba 插件 ，挑选出前 20 个枢纽蛋白 。从这20 个枢纽蛋白挑选出属于 3 个富集最明显 KEGG 通路中的蛋白。
1.12Western 印记法
将另外 8 个样品从 -80 ℃取出 ，置入液氮中研磨 ，将研磨好的粉末置于 1. 5 mL 的 EP 管中 ，按比例加入蛋白裂解液 ，用超声破碎仪超声约 10 s ，使蛋白充分裂解 。将组织置于冰上裂解 30 min ，4 ℃ , 13 700 ×g，离心 20 min。取上清液 ，用 BCA 蛋白检测试剂盒检测总蛋白 ，按比例加入蛋白 上样缓冲液 95 ℃煮沸 10 min。 取 30 μg 蛋白进行 SDS-PAGE 电泳 ，然 后将蛋白转移到 PVDF 膜上。用 5% BSA 室温封闭 2 h ，加入一抗 ，4 ℃ 摇 床孵育过夜 ，TBST 洗膜 3 次后加入 HRP 二抗(1 ∶ 2 000)室温摇床孵育 2h ，继续 TBST 洗膜 3 次 ，用化学发光成像分析仪对条带进行分析。
将曝光所得的条带裁剪好 ，通过 Image J 软件分析条带的灰度值 ，然 后以β -actin 作为内参条带 ，用目标蛋白的灰度值/β -actin 得出该蛋白的相对灰度值。
1.13 统计方法
采用双样本 、双尾 t检验来比较蛋白表达 ，P0.05、差异倍数1.2 时 差异有统计学意义；其他数据均使用 Prism GraphPad 进行统计分析；采 用非参数 t检验来分析组间比较的统计学意义 。 P0.05 为差异有统计学意
义。
2 结 果
2.1 差异表达的蛋白质
本项研究一共鉴定到 6 438 个蛋白质 ，其中 5 697 个蛋白质包含定量 信 息 。 以 1.2 倍 为 变 化 阈 值 ，P0.05 为 标 准 ，在 定 量 到 的 蛋 白 质 中 ， RSA/ Normal 比较组中,鉴定出 342 个差异表达的蛋白 ，其中 208 个蛋白表达发生上调 ，134 个蛋白表达发生下调。
2.2 差异表达蛋白的信号通路分析
基于 KEGG 数据库的富集分析表明 ，上调的差异表达蛋白涉及 7 个富 集较明显的通路 ，包括补体和凝血级联 、 金黄色葡萄球菌感染 、 系统性红 斑狼疮 、 百日咳 、 朊病毒病 、 胆固醇代谢和利什曼病；其中补体级联和凝 血级联富集程度最高 ，见图 1A 。在下调的差异表达蛋白中得到了三条富集 通路;即核糖体 、 类固醇生物合成和胰岛素信号通路 ，其中核糖体通路富集 最为显著 ，见图 1B。另外在所有的富集通路中 ，补体级联和凝血级联 ，以
及核糖体通路中富集到的蛋白数目也是最多的 ，见图 1C。
图 1 所有差异蛋白的 KEGG 通路富集分析A：所有上调差异蛋白的 KEGG 通路富集分析柱状图； B：所有下调差异蛋白的 KEGG 通路富集分析柱状图 ，横轴数值为显著 P值(P0.05)的负对数转换 ，转换后的值越大则此功能类型的富集越显著；C：所有差异表达蛋白
的富集分析气泡图 ，气泡直径大小与该通路涉及到的差异蛋白数目成正相关
2.3 差异表达蛋白的信号网络分析
以 -log(P-value)进行排名 ，列出本次分析中最相关的经典通路(前 20 个) ，-log(P-value)表示该通路在提交数据集中的富集程度 ，值越大表明富 集程度越明显 ，相关性越强 。 从图 2 中可以看出 ，补体系统在所提交的数
据集中富集程度最高。
2.4 枢纽蛋白的验证
通过 Cytoscape 中的 cytohubba 插件 ，基 于 MCC( Maximal Clique Centrality)算法得出各个枢纽蛋白的 score 值 ，score 值越大 ，表示该节点 蛋白在整个网络中占的权重越大 ，取依次排名前 20 的节点 ，在 20 个枢纽 蛋白中 ，有 3 个蛋白分别属于富集最明显的补体系统 ，凝血级联以及核糖
体通路 ，分别是 C3 、 AT- Ⅲ (即 SERPINC1) 、 MRPS7 。 Western印迹法结果显示 ，属于 ribosome 通路中的蛋白 MRPS7 在 RSA 组中下调 ， 而在 complementand coagulation 这个通路里的 2 个蛋白 C3 和 AT- Ⅲ
在 RSA 组中明显上调 。
A：C3、AT- Ⅲ 、 MRPS7 蛋白在正常组对照组与 RSA 组绒毛组织中表达情
况的蛋白印迹图； B：三个蛋白差异表达的统计分析；
P0.05, P0.01, P0.001
表 1 通过 PPI 网络分析及 Cytoscape 软件导出的 20 个枢纽蛋白
Tab.1 Graphical representation of the top 20 hub proteins from the
identifieddifferentially expressed proteins, based on protein-protein
interaction and Cytoscape software analyses
C3 ：补体 3 ，Apo B：载脂蛋白 B ，AHSG ：α -2 -HS-糖蛋白 ，SERPINC1 ：抗凝血酶Ⅲ , ApoA1 ： 载脂蛋白 A1 ，ApoE：载脂蛋白 E ，CP：血浆铜蓝蛋白 ，SERPINA1 ：α -1 -抗胰蛋白酶 ，KNG1 ： 激肽原 -1 ，CLU：丛集素 ，HP ：结合珠蛋白 ，UBA52 ：泛素 -60S 核糖体蛋白 L40 ，MRPS7 ： 线粒体核糖体蛋白 S7 ，SERPING1：血浆蛋白酶 C1 抑制物 ，ITIH2 ：间 - α -胰蛋白抑制物重 链 H2 ，AFP ：α - 甲胎蛋白 ，A2M ：α -2 - 巨球蛋白 ，RPL13A：60S 核糖体蛋白 L13a ，APOH ： β -2 -糖蛋白 1 ，TIMP1 ：基质金属蛋白酶抑制物 1
3 讨 论
RSA 的病因复杂多样 ，常见的有染色体异常 ，子宫解剖结构异常 ，自 身免疫性疾病 ，内分泌失调 ，宫内感染和其他精神神经性因素等[1 -2] 。但是 除了染色体异常这一病因比较明确外 ，临床上仍有至少 40%以上患者病因 不明。复杂的病因造成了 RSA 的难治性 ，探索 RSA 的发病机制是目前基础与临床研究的难点与热点。
研究表明 ，补体系统的异常与不良妊娠结局相关 ，如妊娠早期的自然流 产 ，中晚期的子痫前期以及胎儿生长受限等[5]。作为妊娠期间保护母亲和胎 儿免受感染的补偿性机制 ，补体系统的生理性活化有助于正常妊娠的维持[6]。 而另一方面 ，胎儿作为同种半移植体能够与母体共存 ，免疫耐受在妊娠过 程中起着关键作用 。 胎盘中补体激活过多可能导致胎盘损伤 ，进一步导致 自然流产的发生。抑制补体的激活对正常妊娠的维持是必不可少的[7]。有研 究发现 ，卵母细胞活力的维持是通过抑制补体系统来实现的 ，一 旦这种抑制状态失衡就会导致流产的发生[8]。
凝血系统的异常也参与 RSA 的发病 。 诸多实验结果显示 ，促凝血因子 和抗凝血因子在 RSA 中都发生了上调。Kim 等 [9] 的报道称 RSA 患者卵泡液 中的纤维蛋白原和凝血酶都出现了上调 。而 Pan 等 [10]却发现 ，在早期 RSA 患者的胎盘绒毛中 ，只有凝血酶原出现了上调 。 但其差异也可能是因为后 者主要关注影响早期胚胎生长的相关蛋白 ，而未关注到参与其他功能的纤维蛋白原。
最近的一项研究发现补体和凝血途径相关蛋白质的转录本在 RSA 组中呈现出下调[11] 。 而之前基于 2D 的蛋白组学研究结果也显示 ，与正常妊娠组相比 ，补体 C3 和抗凝血酶的表达在 RSA 组中也下调的[9] 。 但本实验结 果却与之相反 ，即 C3 和抗凝血酶在 RSA 组是上调的 ，其原因可能是由于 二者实验使用的方法不同 ，也有可能是因为实验取材不同 ，因为前者实验 对象为卵泡液 ，卵泡液和胎盘绒毛参与的妊娠阶段不同 ，卵泡液中的蛋白 质主要参与妊娠早期的卵泡成熟以及卵细胞受精 ，而胎盘绒毛自胚胎植入 子宫内膜后 ，便参与整个妊娠期的维持 。 由于绒毛组织在正常妊娠的维持 中发挥着重要作用 ，因此 ，需要进一步探索胎盘绒毛中补体和凝血途径与 RSA 的相关性 。此外 ，目前已知 C3 是组织免疫细胞特异性表达的分子 ，但 有研究发现 ，C3 的转录本在反复妊娠丢失的绒毛组织中表达增加[12] ，而本 实验也发现 C3 在 RSA 中的胎盘绒毛组织中的表达是上调的 ，这导致对 C3 表达范围产生了新的思考 ，即 C3 这一免疫调节分子是否仅局限表达于免疫细胞。
综上所述 ，在 RSA 发病过程中 ，补体和凝血系统失调是与之密切相关 的 ，但具体是上调还是下调还有待进一步阐明和证实 。 此外 ，上调也不完 全等于激活 ，因为补体活化始于参与补体蛋白(比如 C3 和 C5)的级联放大的 剪切作用 ，并伴随着补体的消耗以及蛋白沉积形成膜攻击复合物 。 因此当 该系统激活时 ，也可能表现为补体减少或下调 。 该假设也同样适用于凝血 系统 。 最后 ，补体系统和凝血系统在妊娠相关疾病中的致病机制也并不完 全独立 ，而是相互制衡 ，又相互促进的 。 因为在正常生理情况下 ，免疫细 胞和炎性介质能够调节凝血系统 ，反过来 ，凝血途径中的一些分子又有明显的免疫调节作用[13]。
除了补体和凝血系统的变化 ，此次研究还发现核糖体通路在 RSA 中呈 现下调 。X in 等 [14] 以早期妊娠丢失(early pregnancy loss, EPL)患者为研究 对象 ，用同样的方法和组织样本 ，发现核糖体功能在 EPL 中被抑制 。 另一 项研究同样以绒毛组织为样本 ，发现核糖体通路相关基因的转录本在 RSA 组中呈现明显下降[12]。核糖体主要参与 mRNA 翻译和蛋白质生成 ，这是参 与机体代谢中至关重要的过程[15]。而在本研究中 ，蛋白组学数据显示在总共 314 个差异蛋白中 ，其中有 213 个参与代谢过程的蛋白水平发生了变化 ， 因而猜测可能是因为核糖体功能受抑制影响了代谢过程 ，最终导致 RSA 的发生。
RSA 患者胎盘绒毛组织中鉴定出的差异蛋白能为 RSA 致病的分子机制 研究提供有价值的研究思路 。 尽管本次实验结果与之前报道过的研究有出 入 ，但在鉴定出的结果中 ，也有一些不容忽视的共性 。 因此 ，为了更充分
地阐明 RSA 的致病机制 ，有必要使用多种方法以进行相互补充 ，相互验证。
引用自同济大学学报医学版2021-05-22 09:00发表于上海
复发性流产患者胎盘绒毛组织中差异表达蛋白的蛋白质组学分析
复发性流产(recurrent spontaneous abortion ，RSA)是指与同一性伴 侣连续发生≥2 次在妊娠 20 周前的胎儿丢失[1] ，是一种极为常见的妊娠并 发症 ，大约每 300 名孕妇中就有 1 位会发生 RSA[2] 。复发性流产的病因复 杂多样 ，比如父母染色体异常 ，母亲生殖道解剖结构异常 ，自身免疫性疾 病 ，内分泌失调 ，感染和精神等诸多因素[3 -4] 。然而 ，除了这些比较明确的病因外 ，临床上仍有将 40%～ 50%的 RSA 患者病因不明。
蛋白质组学在探索疾病生物标志物和病理生理机制等方面拥有巨大的 潜力 。本研究通过蛋白组学方法对 RSA 相关的分子信号通路进行综合性的 研究 ，寻找潜在的分子机制 ，以期发现新的分子靶点 ，从而降低 RSA 发生
1.9 通路富集分析
采用 KEGG 数据库进行通路的富集分析 。 费歇尔精确双端检验方法被 用于检验差异表达蛋白在以鉴定到的蛋白为背景。通路富集检验 P0.05 认 为差异有统计学意义 。 最后根据 KEGG 网站通路层级分类方法将这些通路
进行分类。
1.10 差异蛋白的网络信号分析(IPA)
将包含所有差异表达蛋白质的列表(以 Uni Prot 编号形式)和差异倍数值 上传到 IPA 软件(2000— 2018QIAGEN)中进行分析 。 P值在 IPA 中基于Right-Tailed Fisher ’s Exact Test 算法 ，可以分析相关的经典通路。
1.11 蛋白互作网络(PPI)分析与枢纽蛋白
将 342 个差异蛋白分子 ，上传至 STRING 网站(https：∥http://string-db.org/) ， 将 网 络 互 作 结 果 导 出 。 再 将 导 出 的 string_interactions.tsv 文 件 导 入 Cytoscape 软件 ，运用 cytohubba 插件 ，挑选出前 20 个枢纽蛋白 。从这20 个枢纽蛋白挑选出属于 3 个富集最明显 KEGG 通路中的蛋白。
1.12Western 印记法
将另外 8 个样品从 -80 ℃取出 ，置入液氮中研磨 ，将研磨好的粉末置于 1. 5 mL 的 EP 管中 ，按比例加入蛋白裂解液 ，用超声破碎仪超声约 10 s ，使蛋白充分裂解 。将组织置于冰上裂解 30 min ，4 ℃ , 13 700 ×g，离心 20 min。取上清液 ，用 BCA 蛋白检测试剂盒检测总蛋白 ，按比例加入蛋白 上样缓冲液 95 ℃煮沸 10 min。 取 30 μg 蛋白进行 SDS-PAGE 电泳 ，然 后将蛋白转移到 PVDF 膜上。用 5% BSA 室温封闭 2 h ，加入一抗 ，4 ℃ 摇 床孵育过夜 ，TBST 洗膜 3 次后加入 HRP 二抗(1 ∶ 2 000)室温摇床孵育 2h ，继续 TBST 洗膜 3 次 ，用化学发光成像分析仪对条带进行分析。
将曝光所得的条带裁剪好 ，通过 Image J 软件分析条带的灰度值 ，然 后以β -actin 作为内参条带 ，用目标蛋白的灰度值/β -actin 得出该蛋白的相对灰度值。
1.13 统计方法
采用双样本 、双尾 t检验来比较蛋白表达 ，P0.05、差异倍数1.2 时 差异有统计学意义；其他数据均使用 Prism GraphPad 进行统计分析；采 用非参数 t检验来分析组间比较的统计学意义 。 P0.05 为差异有统计学意
义。
2 结 果
2.1 差异表达的蛋白质
本项研究一共鉴定到 6 438 个蛋白质 ，其中 5 697 个蛋白质包含定量 信 息 。 以 1.2 倍 为 变 化 阈 值 ，P0.05 为 标 准 ，在 定 量 到 的 蛋 白 质 中 ， RSA/ Normal 比较组中,鉴定出 342 个差异表达的蛋白 ，其中 208 个蛋白表达发生上调 ，134 个蛋白表达发生下调。
2.2 差异表达蛋白的信号通路分析
基于 KEGG 数据库的富集分析表明 ，上调的差异表达蛋白涉及 7 个富 集较明显的通路 ，包括补体和凝血级联 、 金黄色葡萄球菌感染 、 系统性红 斑狼疮 、 百日咳 、 朊病毒病 、 胆固醇代谢和利什曼病；其中补体级联和凝 血级联富集程度最高 ，见图 1A 。在下调的差异表达蛋白中得到了三条富集 通路;即核糖体 、 类固醇生物合成和胰岛素信号通路 ，其中核糖体通路富集 最为显著 ，见图 1B。另外在所有的富集通路中 ，补体级联和凝血级联 ，以
及核糖体通路中富集到的蛋白数目也是最多的 ，见图 1C。
图 1 所有差异蛋白的 KEGG 通路富集分析A：所有上调差异蛋白的 KEGG 通路富集分析柱状图； B：所有下调差异蛋白的 KEGG 通路富集分析柱状图 ，横轴数值为显著 P值(P0.05)的负对数转换 ，转换后的值越大则此功能类型的富集越显著；C：所有差异表达蛋白
的富集分析气泡图 ，气泡直径大小与该通路涉及到的差异蛋白数目成正相关
2.3 差异表达蛋白的信号网络分析
以 -log(P-value)进行排名 ，列出本次分析中最相关的经典通路(前 20 个) ，-log(P-value)表示该通路在提交数据集中的富集程度 ，值越大表明富 集程度越明显 ，相关性越强 。 从图 2 中可以看出 ，补体系统在所提交的数
据集中富集程度最高。
2.4 枢纽蛋白的验证
通过 Cytoscape 中的 cytohubba 插件 ，基 于 MCC( Maximal Clique Centrality)算法得出各个枢纽蛋白的 score 值 ，score 值越大 ，表示该节点 蛋白在整个网络中占的权重越大 ，取依次排名前 20 的节点 ，在 20 个枢纽 蛋白中 ，有 3 个蛋白分别属于富集最明显的补体系统 ，凝血级联以及核糖
体通路 ，分别是 C3 、 AT- Ⅲ (即 SERPINC1) 、 MRPS7 。 Western印迹法结果显示 ，属于 ribosome 通路中的蛋白 MRPS7 在 RSA 组中下调 ， 而在 complementand coagulation 这个通路里的 2 个蛋白 C3 和 AT- Ⅲ
在 RSA 组中明显上调 。
A：C3、AT- Ⅲ 、 MRPS7 蛋白在正常组对照组与 RSA 组绒毛组织中表达情
况的蛋白印迹图； B：三个蛋白差异表达的统计分析；
P0.05, P0.01, P0.001
表 1 通过 PPI 网络分析及 Cytoscape 软件导出的 20 个枢纽蛋白
Tab.1 Graphical representation of the top 20 hub proteins from the
identifieddifferentially expressed proteins, based on protein-protein
interaction and Cytoscape software analyses
C3 ：补体 3 ，Apo B：载脂蛋白 B ，AHSG ：α -2 -HS-糖蛋白 ，SERPINC1 ：抗凝血酶Ⅲ , ApoA1 ： 载脂蛋白 A1 ，ApoE：载脂蛋白 E ，CP：血浆铜蓝蛋白 ，SERPINA1 ：α -1 -抗胰蛋白酶 ，KNG1 ： 激肽原 -1 ，CLU：丛集素 ，HP ：结合珠蛋白 ，UBA52 ：泛素 -60S 核糖体蛋白 L40 ，MRPS7 ： 线粒体核糖体蛋白 S7 ，SERPING1：血浆蛋白酶 C1 抑制物 ，ITIH2 ：间 - α -胰蛋白抑制物重 链 H2 ，AFP ：α - 甲胎蛋白 ，A2M ：α -2 - 巨球蛋白 ，RPL13A：60S 核糖体蛋白 L13a ，APOH ： β -2 -糖蛋白 1 ，TIMP1 ：基质金属蛋白酶抑制物 1
3 讨 论
RSA 的病因复杂多样 ，常见的有染色体异常 ，子宫解剖结构异常 ，自 身免疫性疾病 ，内分泌失调 ，宫内感染和其他精神神经性因素等[1 -2] 。但是 除了染色体异常这一病因比较明确外 ，临床上仍有至少 40%以上患者病因 不明。复杂的病因造成了 RSA 的难治性 ，探索 RSA 的发病机制是目前基础与临床研究的难点与热点。
研究表明 ，补体系统的异常与不良妊娠结局相关 ，如妊娠早期的自然流 产 ，中晚期的子痫前期以及胎儿生长受限等[5]。作为妊娠期间保护母亲和胎 儿免受感染的补偿性机制 ，补体系统的生理性活化有助于正常妊娠的维持[6]。 而另一方面 ，胎儿作为同种半移植体能够与母体共存 ，免疫耐受在妊娠过 程中起着关键作用 。 胎盘中补体激活过多可能导致胎盘损伤 ，进一步导致 自然流产的发生。抑制补体的激活对正常妊娠的维持是必不可少的[7]。有研 究发现 ，卵母细胞活力的维持是通过抑制补体系统来实现的 ，一 旦这种抑制状态失衡就会导致流产的发生[8]。
凝血系统的异常也参与 RSA 的发病 。 诸多实验结果显示 ，促凝血因子 和抗凝血因子在 RSA 中都发生了上调。Kim 等 [9] 的报道称 RSA 患者卵泡液 中的纤维蛋白原和凝血酶都出现了上调 。而 Pan 等 [10]却发现 ，在早期 RSA 患者的胎盘绒毛中 ，只有凝血酶原出现了上调 。 但其差异也可能是因为后 者主要关注影响早期胚胎生长的相关蛋白 ，而未关注到参与其他功能的纤维蛋白原。
最近的一项研究发现补体和凝血途径相关蛋白质的转录本在 RSA 组中呈现出下调[11] 。 而之前基于 2D 的蛋白组学研究结果也显示 ，与正常妊娠组相比 ，补体 C3 和抗凝血酶的表达在 RSA 组中也下调的[9] 。 但本实验结 果却与之相反 ，即 C3 和抗凝血酶在 RSA 组是上调的 ，其原因可能是由于 二者实验使用的方法不同 ，也有可能是因为实验取材不同 ，因为前者实验 对象为卵泡液 ，卵泡液和胎盘绒毛参与的妊娠阶段不同 ，卵泡液中的蛋白 质主要参与妊娠早期的卵泡成熟以及卵细胞受精 ，而胎盘绒毛自胚胎植入 子宫内膜后 ，便参与整个妊娠期的维持 。 由于绒毛组织在正常妊娠的维持 中发挥着重要作用 ，因此 ，需要进一步探索胎盘绒毛中补体和凝血途径与 RSA 的相关性 。此外 ，目前已知 C3 是组织免疫细胞特异性表达的分子 ，但 有研究发现 ，C3 的转录本在反复妊娠丢失的绒毛组织中表达增加[12] ，而本 实验也发现 C3 在 RSA 中的胎盘绒毛组织中的表达是上调的 ，这导致对 C3 表达范围产生了新的思考 ，即 C3 这一免疫调节分子是否仅局限表达于免疫细胞。
综上所述 ，在 RSA 发病过程中 ，补体和凝血系统失调是与之密切相关 的 ，但具体是上调还是下调还有待进一步阐明和证实 。 此外 ，上调也不完 全等于激活 ，因为补体活化始于参与补体蛋白(比如 C3 和 C5)的级联放大的 剪切作用 ，并伴随着补体的消耗以及蛋白沉积形成膜攻击复合物 。 因此当 该系统激活时 ，也可能表现为补体减少或下调 。 该假设也同样适用于凝血 系统 。 最后 ，补体系统和凝血系统在妊娠相关疾病中的致病机制也并不完 全独立 ，而是相互制衡 ，又相互促进的 。 因为在正常生理情况下 ，免疫细 胞和炎性介质能够调节凝血系统 ，反过来 ，凝血途径中的一些分子又有明显的免疫调节作用[13]。
除了补体和凝血系统的变化 ，此次研究还发现核糖体通路在 RSA 中呈 现下调 。X in 等 [14] 以早期妊娠丢失(early pregnancy loss, EPL)患者为研究 对象 ，用同样的方法和组织样本 ，发现核糖体功能在 EPL 中被抑制 。 另一 项研究同样以绒毛组织为样本 ，发现核糖体通路相关基因的转录本在 RSA 组中呈现明显下降[12]。核糖体主要参与 mRNA 翻译和蛋白质生成 ，这是参 与机体代谢中至关重要的过程[15]。而在本研究中 ，蛋白组学数据显示在总共 314 个差异蛋白中 ，其中有 213 个参与代谢过程的蛋白水平发生了变化 ， 因而猜测可能是因为核糖体功能受抑制影响了代谢过程 ，最终导致 RSA 的发生。
RSA 患者胎盘绒毛组织中鉴定出的差异蛋白能为 RSA 致病的分子机制 研究提供有价值的研究思路 。 尽管本次实验结果与之前报道过的研究有出 入 ，但在鉴定出的结果中 ，也有一些不容忽视的共性 。 因此 ，为了更充分
地阐明 RSA 的致病机制 ，有必要使用多种方法以进行相互补充 ，相互验证。
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